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    Génétique

    Formidable CRISPR-Cas9

    Une structure du Cas9 de S. pyogenes (une bactérie appartenant au genre «Streptococcus») dans un complexe avec notamment son ADN cible
    Photo: ChobitParrot / Creative Commons Une structure du Cas9 de S. pyogenes (une bactérie appartenant au genre «Streptococcus») dans un complexe avec notamment son ADN cible

    CRISPR-Cas9, cet acronyme bizarroïde qui a envahi la littérature scientifique et a fait la manchette à maintes reprises en 2015, désigne un extraordinaire outil permettant de modifier le génome à volonté. CRISPR-Cas9 fait rêver les chercheurs qui espèrent corriger les mutations génétiques à l’origine de maladies héréditaires, rendre les cellules sanguines résistantes au VIH, et beaucoup plus… La puissance de cette technique est telle que la communauté scientifique s’est réunie en décembre dernier afin d’en interdire l’usage dans le but d’effectuer des modifications chez l’humain qui se transmettraient aux générations futures.

    C’est en essayant de comprendre comment certaines bactéries lactiques arrivaient à se défendre contre les virus qui les attaquaient que des chercheurs ont découvert le système CRISPR-Cas9, en 2007. Sylvain Moineau, de l’Université Laval, qui a contribué à mettre en lumière le fonctionnement de ce moyen de défense, travaillait alors avec des collaborateurs français et américains sur la bactérie Streptococcus thermophilus qui est utilisée pour la fermentation du yogourt et du fromage. « Il arrive à l’occasion que ces bactéries se font attaquer par des virus, appelés phages, qui sont naturellement présents dans le lait. La pasteurisation n’élimine que les cellules pathogènes, mais il subsiste de ces petits phages qui ne sont pas dangereux pour les humains mais qui détruisent les bactéries qui ne feront plus leur travail. On se ramasse alors avec un fromage de mauvaise qualité ou pas de fromage du tout ! » explique M. Moineau, avant d’ajouter que les bactéries ont développé au cours de l’évolution divers mécanismes leur permettant de résister aux phages. Quelques-uns d’entre eux étaient déjà connus, et en 2007, M. Moineau et ses collègues en ont caractérisé un nouveau, qui a été nommé Clustered regularly interspaced short palindromic repeats — associated protein 9 (Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées), fréquemment désigné sous l’acronyme CRISPR-Cas9. « Seulement la moitié des espèces de bactéries possèdent le système crspr-cas et celui-ci est dominant chez les bactéries du yogourt et du fromage », précise M. Moineau, qui est professeur au Département de biochimie, microbiologie et bio-informatique de la Faculté des sciences et génie de l’Université Laval.

     

    Fonctionnement de CRISPR-Cas9

     

    Lorsqu’une bactérie est infectée par un phage, et que ce dernier pénètre à l’intérieur de la bactérie, le système CRISPR-Cas de la bactérie s’empare d’une portion du génome du virus et l’insère dans le génome de la bactérie à un endroit spécifique, appelé locus du CRISPR. De ce locus sont ensuite produits de petits ARN, dont une partie de la séquence est complémentaire à celle de l’ADN du phage qui a été intégrée au génome de la bactérie. L’autre partie de l’ARN complémentaire (ARNc) se lie à une enzyme, en l’occurrence une nucléase appelée Cas9, qui a le pouvoir de couper l’ADN comme le feraient des ciseaux.

     

    « Ce complexe formé de l’ARNc et de l’ADN de la Cas9 agit comme un anticorps », explique M. Moineau. Ces anticorps se promènent dans la cellule et jouent le rôle de sentinelles qui guettent l’arrivée de phages similaires à celui qu’elles doivent combattre. Ainsi, dès qu’un nouveau phage entre dans la bactérie, l’ARNc reconnaît la portion de l’ADN du phage qui lui correspond et va s’y fixer. La liaison entre l’ARNc et l’ADN du phage entraîne l’activation de la protéine Cas9, qui coupe l’ADN du phage venant d’entrer dans la cellule. La section du génome du phage entraîne alors sa mort. « Ce mécanisme est naturel. Il se met en branle naturellement dans les cellules », souligne M. Moineau, qui a mis en évidence le rôle de la Cas9 et celui des ARNc chez les bactéries lactiques.

     

    Outil d’édition du génome

     

    Par la suite, la biologiste moléculaire Jennifer Doudna, de l’Université de Californie à Berkeley, et la microbiologiste française Emmanuelle Charpentier, de l’Institut Max Planck de Berlin, d’un côté, et Feng Zhang du Broad Institute de Cambridge, au Massachusetts, ont compris que ce système naturel pourrait s’avérer un outil fort utile.

     

    « Ils ont domestiqué le système CRISPR-Cas9. Ils ont rassemblé dans un même vecteur le petit ARNc et une portion du locus CRISPR qui comprend le gène codant pour Cas9. Ce vecteur peut ensuite être introduit dans des cellules végétales, animales ou humaines, précise Sylvain Moineau. La beauté du système est que l’on peut changer la séquence du petit ARNc à volonté. On peut changer cette séquence pour qu’elle soit complémentaire à n’importe quelle région spécifique du génome que l’on veut modifier, et pour qu’elle puisse ainsi la reconnaître lorsqu’on l’introduira dans une cellule. On change ainsi la spécificité de nos ciseaux [c’est-à-dire la Cas9] simplement en changeant la séquence de ce petit ARN. »

     

    Lorsque l’ARNc se fixe à la séquence d’ADN de la cellule que l’on désire modifier, l’enzyme Cas9 coupe les deux brins d’ADN. « Cette coupure met la vie de la cellule en péril si elle n’est pas réparée. Mais heureusement, la cellule possède des mécanismes de réparation car des accidents de ce genre sont assez fréquents », indique M. Moineau.

     

    « La cassure des deux brins d’ADN de la cellule met en branle le système de réparation. Or, si à ce moment-là on fournit alors à la cellule un ADN donneur contenant les changements que l’on désire apporter, des enzymes copieront cet ADN et l’intégreront exactement à l’endroit où le double brin a été coupé », explique Jerry Pelletier, professeur au Département de biochimie de l’Université McGill.

     

    L’ADN donneur peut contenir une mutation que l’on veut introduire ou le gène exempt de la mutation que l’on cherche à éliminer, par exemple.

     

    Comparativement aux techniques précédentes, la CRISPR-Cas9 est beaucoup plus précise et permet d’effectuer des modifications génétiques beaucoup plus facilement et rapidement. Pour toutes ces raisons, son emploi s’est répandu comme une traînée de poudre dans les laboratoires.

     

    Applications

     

    Actuellement, la technique CRISPR-Cas9 est surtout utilisée en recherche fondamentale. « Beaucoup de progrès ont été faits en génomique. On séquence des génomes à une vitesse incroyable, mais en fin de compte, il reste encore beaucoup de gènes dont on ne connaît pas la fonction. Or, le système CRISPR-Cas9 nous permet d’inactiver un gène (en le mutant) pour voir ce que cela entraîne dans la cellule [ce qu’on appelle la génétique inverse]. C’est fabuleux. Ça va accélérer notre compréhension du génome », fait valoir M. Moineau.

     

    Yannick Doyon, professeur au Département de médecine moléculaire du Centre de recherche du CHU de Québec-Université Laval, a réussi à corriger les défauts génétiques responsables de l’hémophilie chez un modèle de souris de la maladie. Toujours chez la souris, il s’applique maintenant à faire les corrections génétiques nécessaires pour guérir des maladies métaboliques d’origine génétique, comme la tyrosinémie, des maladies rares mais qui sont plus fréquentes au Québec en raison de l’effet fondateur.

     

    L’équipe de Jacques-P. Tremblay, de la Faculté de médecine et du CHU de Québec-Université Laval, publiait un article cette semaine dans lequel elle explique avoir utilisé le système CRISPR-Cas9 pour réparer le gène responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne dans des cellules humaines cultivées en laboratoire, un tout premier pas, mais un pas important dans la lutte contre cette maladie impitoyable qui fauche les garçons avant l’âge de 25 ans.

     

    L’équipe de Jerry Pelletier, à McGill, a recours au système CRISPR-Cas9 pour mieux comprendre le dérèglement que subissent les cellules qui deviennent cancéreuses. « Quand une cellule devient cancéreuse, la nature et l’abondance des protéines qu’elle synthétise changent. Elle produit plus de certaines protéines et moins de certaines autres, ce qui lui permet de croître plus rapidement et de devenir résistante au stress. Nous mutons certains gènes que nous croyons impliqués dans la régulation de ce processus et nous regardons l’effet de ces mutations sur la production des protéines. Si nous voyons quelque chose nous indiquant qu’il s’agit d’un gène stratégique, nous chercherons une drogue qui pourrait agir sur ce gène ou la protéine qu’il synthétise », explique M. Pelletier.

     

    Des essais cliniques visant à rendre les cellules T sanguines résistantes au VIH devraient débuter sous peu. Pour ce faire, on prélèvera des cellules T de patients. Puis, on introduira dans le génome de ces cellules une mutation qui inactivera les récepteurs sur lesquels se fixe le VIH lorsqu’il s’apprête à les investir. Ces cellules seront ensuite réinfusées aux patients. « Ces essais cliniques ont lieu avec un autre système plus ancien que Cas9, le zinc ZFN [zinc figer nuclease, ou nucléase à doigt de zinc], mais il serait plus facile, plus rapide et préférable d’utiliser Cas9 », précise Jerry Pelletier.

     

    Dans un article scientifique publié en avril 2015, l’équipe de Junjiu Huang, de l’Université Sun Yat-sen en Chine, décrivait avoir employé la technologie CRISPR-Cas9 pour réparer le gène responsable de la ß-thalassémie, une maladie sanguine héréditaire chez des embryons humains. Cette publication a soulevé un tollé au sein de la communauté scientifique. Le chercheur chinois s’est alors défendu d’avoir réalisé ces expériences sur des embryons non viables, qui ne se seraient jamais développés complètement, et qu’il avait voulu simplement montrer que la technique n’était pas encore assez sûre pour de telles utilisations chez l’humain.

     

    Moratoire

     

    En raison de l’inquiétude suscitée par cette publication, l’Académie nationale des sciences des États-Unis, l’Académie des sciences de Chine et la Société royale de Londres ont organisé une rencontre en décembre dernier à Washington afin de discuter de la possibilité d’imposer un moratoire sur l’utilisation du système CRISPR-Cas9 pour modifier le génome des cellules germinales humaines, car ces cellules, qui sont issues des toutes premières cellules embryonnaires et qui forment les ovules et les spermatozoïdes, transmettent les changements qu’elles ont subis à leur descendance.

     

    Alors que la thérapie génique, une technique médicale bien acceptée qui consiste à corriger la mutation — causant une maladie génétique — directement dans les cellules du tissu affecté d’un individu, procéder à de telles corrections dans les cellules germinales engendre la transmission de cette modification aux enfants du patient. Or, si cette démarche devenait courante, elle finirait par altérer la nature de l’espèce humaine, font valoir certains scientifiques. Ces derniers rappellent que les maladies qui sont causées par un seul gène défectueux sont rares et qu’on peut très souvent les prévenir en ayant recours à la fécondation in vitro et en implantant dans l’utérus de la femme uniquement des embryons qui auront été diagnostiqués exempts de la mutation.

     

    D’autres chercheurs ont souligné le fait que s’il est permis de modifier le génome des cellules germinales, la tentation sera grande de favoriser l’expression de traits physiques ou mentaux désirables, et de créer des bébés répondant à tous nos désirs.

     

    Les chercheurs réunis en sont arrivés à la conclusion que la technique CRISPR-Cas9 n’est pas encore suffisamment sûre pour que son utilisation soit autorisée dans les cellules germinales.

     

    « Nous ne sommes vraiment pas prêts pour des modifications génétiques chez l’humain. Il est très important qu’il y ait un moratoire car cette technologie est utilisée depuis peu et contient encore des boîtes noires qu’il nous faut élucider », affirme Sylvain Moineau.

     

    Le système CRISPR-Cas9 est beaucoup plus précis et efficace que les outils précédents, mais il n’est pas parfait. Parfois, le système CRISPR-Cas9 ne coupe pas les brins d’ADN exactement à l’endroit désiré. « En recherche, ce n’est pas un problème car nous avons des façons de vérifier si la coupure a eu lieu au bon endroit. Mais quand cela se passe chez l’humain, c’est une autre paire de manches, cela peut être problématique, prévient M. Moineau. Une fois qu’on aura maîtrisé la technique et qu’on aura diminué ce risque, pourquoi pas ? Mais pour l’instant, non. »

     

    Jerry Pelletier croit aussi que les chercheurs ne sont absolument pas prêts pour procéder à des corrections sur des embryons humains. Il explique que la « coupure hors cible » est un problème de taille qu’il faudra surmonter avant d’envisager d’intervenir sur des embryons humains. Celle-ci peut survenir lorsque, par exemple, « 15 des 20 nucléotides qui composent l’ARN complémentaire que nous avions préparé reconnaissent une autre séquence dans le génome qui n’est pas à l’endroit que nous avions prévu », précise M. Pelletier.

     

    Yannick Doyon ajoute que si l’ARN guide « n’est pas totalement spécifique », et qu’il ne se fixe pas à l’endroit prévu, des mutations pourront apparaître à des endroits non désirés. « Pour le moment, ces techniques-là sont utilisées uniquement en recherche fondamentale », dit-il avant de souligner l’importance de poursuivre le débat, car « la technologie est tellement accessible et facile à utiliser ».













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